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又一篇!天昊生物微生物16S擴增子絕對定量測序技術再發好文

發稿時間:2019-10-23來源:天昊生物


濰坊醫學院楊潔教授課題組近期在《Carbohydrate Polymers》上發表了綠刺參巖藻糖基硫酸軟骨素的鏈構象、理化性質及其體外發酵的文章。在這項研究中使用了天昊生物創新型的的微生物16S擴增子絕對定量測序技術。在恭喜客戶發表文章同時,我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目:Chain conformation, physicochemical properties of fucosylated chondroitin

sulfate from sea cucumber Stichopus chloronotus and its in vitro fermentation by human gut microbiota

中文題目:綠刺參巖藻糖基硫酸軟骨素的鏈構象、理化性質及其體外發酵

期刊名:Carbohydrate Polymers 

影響因子: 6.044

研究概要

本文采用HPSEC-MALLS和worm-like cylinder模型方法研究了綠刺參巖藻糖基硫酸軟骨素(fCS-Sc)的鏈構象和理化性質,同時通過16S擴增子絕對定量測序研究它對人體腸道菌群的影響。結果表明綠刺參巖藻糖基硫酸軟骨素(fCS-Sc) 在PBS中采用剛性棒狀鏈構象,鏈構象參數分別為αη(1.11)和αh(0.70)。從worm-like cylinder模型推導出的剛度參數表明fCS-Sc表現為剛性鏈。剛果紅分析顯示為單螺旋結構。fCS-Sc在較寬的ph范圍內表現出負的zeta電位和良好的熱穩定性。此外,fCS-Sc還可以通過提高腸道菌群的絕對豐度來調節腸道菌群的群落結構,例如增加有益菌MegamonasBacteroidesFusobacteriumParabacteroidesPrevotellaFaecalibacterium,抑制病原微生物,從而促進短鏈脂肪酸的產生。本研究進一步加深了對fCS-Sc空間結構的認識,以及fCS-Sc作為益生元的應用。

研究背景

巖藻糖基硫酸軟骨素(fCS)是從海參中提取的一種獨特的天然硫酸軟骨素類似物,含有硫酸巖藻糖支鏈。從不同海參中獲得的巖藻糖基硫酸軟骨素(fCS)結構各不相同。不同種類海參的fCS具有相似的硫酸軟骨素骨架結構和不同硫酸基取代的巖藻糖分支。巖藻糖基硫酸軟骨素(fCS)因其多種生物活性而受到廣泛關注,它具有明顯的抗凝、抑制腫瘤轉移、抗病毒、改善高血糖等作用。

目前已經發現多糖的化學結構如單糖組成、糖苷結構、取代基、分子量和鏈構象對其活性有明顯的影響。HPSEC-MALLS技術被廣泛應用于多糖鏈構象的測定。近年來人們利用SEC-MALLS方法對fCS的鏈構象進行了研究。從刺參Apostichopus japonicus中提取的fCS在0.15 M NaCl(ph 7.4)中具有隨機的線圈結構。在0.2M的NaCl溶液中, Isostichopus badionotusPearsonothuria graeffei 的fCS具有隨機的螺旋構象。然而,從綠刺參中分離得到的fCS的鏈構象還沒有研究。

近年來,生物活性多糖的益生元功能受到了廣泛關注。腸道菌群作為一種功能器官,在人類健康與宿主飲食的相互作用中發揮著重要作用。同時,闡明益生元組分與腸道菌群之間的聯系有助于其作為功能性食品的應用。由于人類消化系統不能產生足夠的碳水化合物水解酶,腸道微生物群在多糖代謝中發揮著重要作用。腸道微生物群降解多糖,產生短鏈脂肪酸(SCFAs,如乙酸、丙酸和丁酸),在維持上皮屏障功能、調節上皮細胞增殖、調節免疫功能、預防結直腸癌等方面發揮重要作用。在我們之前的研究中,我們從綠刺參中獲得了一種巖藻糖基硫酸軟骨素(fCS-Sc),并對其化學結構進行了表征研究。為進一步闡明其構效關系,采用HPSEC-MALLS方法對鏈構象進行了測定,并worm-like cylinder模型方法進行了進一步的解釋,研究了zeta電位和熱穩定性等物理化學性質,同時也是首次對fCS-Sc的體外發酵進行了研究。

研究方法

fCS-Sc體外發酵:

根據文獻報道,對fCS-Sc進行了體外發酵研究。將fCS-Sc或低聚果糖(FOS,陽性對照)溶于培養基中(10mg/ml),高壓滅菌。新鮮糞便樣本來自三名自愿捐贈者(兩名女性和一名男性,年齡25-35歲),他們在三個月內沒有胃腸道疾病或抗生素治療。將每個供者的相同量糞便樣本混合,用PBS稀釋成10%(w/v)的糞漿,以500rpm離心5min,除去食物殘渣。然后,將9ml空白培養基(對照組)或含fCS-Sc或FOS的培養基與1ml糞漿混合。將混合物立即放入厭氧培養箱中,37℃孵育24小時。在Silgreen陽離子交換柱(300×7.8mm)上分析培養基中的SCFAs含量,用8mM H2 SO4洗脫,215nm檢測。

16S擴增子絕對定量測序:

使用FastDNA? SPIN Kit (MP Biomedicals, LLC, USA)提取樣本微生物基因組DNA,然后在上海天昊生物科技有限公司進行16S擴增子絕對定量測序(V3-V4)。


研究結果

fCS-Sc的理化性質

HPSEC-MALLS-Visc-RI結果表明,fCS-Sc在PBS中呈剛性棒狀鏈構象。Mw、[η]、Rh和構象參數αη和αh分別為63.2±0.6 kDa、64.1±0.3mL/g、9.62±0.03nm、1.11±0.01和0.70±0.01。根據類蠕蟲柱體模型計算了更多的構象參數,結果表明,ML,q,d, C分別為793g/mol?nm、11.22±0.60nm、1.00nm和21.4,結果表明fCS-Sc具有一定的鏈剛度。剛果紅試驗表明,fCS-Sc具有高度有序的單螺旋結構。fCS-Sc在較寬的ph范圍內呈現負zeta電位,熱穩定性較好。

fCS-Sc對腸道菌群的影響

采用新鮮人糞便體外發酵和高通量測序分析,研究fCS-Sc對腸道菌群的影響。9個樣品(3組,每組3個重復)共獲得3099052條原始序列。在對原始序列進行過濾并以97%的相似性進行聚類后,每個樣本獲得254±19個OTUs。樣本稀疏曲線和shannon曲線都表明測序深度覆蓋了最大的多樣性。不同組別產生的OTUs的venn圖顯示,所有組別共有246個OTUs。如表1所示,與對照組相比,fCS-Sc組的群落豐富度指數chao1和ACE指數顯著高于對照組。fCS-Sc組的群落多樣性指數(shannon指數)也明顯高于對照組,這些結果表明fCS-Sc能促進腸道微生物的豐富性和多樣性。

1 不同組別的alpha多樣性

主坐標分析(PCoA)結果表明,fCS-Sc處理后,三組菌群的微生物組成有明顯的聚集性,微生物結構有明顯的變化(圖5a)。上述結論也得到了OTUs水平Bray-Curtis聚類分析結果的證實(圖5b)


基于主坐標分析(a)、聚類分析(b)的微生物群落結構差異研究

不同于以往對特定樣品中微生物相對豐度的研究,靶向微生物在不同樣品間的絕對豐度越來越受到關注。樣品中微生物群的絕對定量是通過添加spike-in序列及其生成的標準曲線來實現的。各細菌類群在門水平上的相對豐度和絕對拷貝數如圖6a所示,結果表明,隨著fCS-Sc和FOS的處理,微生物組成發生了明顯變化。尤其是fCS-Sc處理組的微生物絕對豐度是對照組的2.74倍,說明fCS-Sc是一種有效的益生元,能顯著促進腸道微生物的生長。此外,FOS能促進微生物群的生長,比對照組增加1.33倍。在門的水平上,腸道微生物群主要由ProteobacteriaFirmicutesBacteroidetesActinobacteriaFusobacteria組成(圖6a)。厚壁菌/類桿菌比例 (F/B) 與高熱量飲食引起的肥胖密切相關,從圖6a可以看出,與對照組相比,fCS-Sc和FOS顯著降低了F/B比值,分別從6.83降至1.55和3.12(p<0.05),說明fCS-Sc通過降低厚壁菌/類桿菌比值來有利宿主健康。結果還表明,fCS-Sc的發酵主要是由擬桿菌和梭桿菌引起的。在屬水平上(圖6b),腸道菌群主要由Escherichia/ShigellaClostridium_XlVaMegamonasDialisterBacteroidesFusobacteriumBifidobacterium等組成,與對照組相比,fCS-Sc和FOS處理組的腸道菌群組成有明顯變化,說明fCS-Sc和FOS能顯著促進某些不同種類腸道菌群的生長。


主要細菌在門(a)和屬(b)水平上的相對豐度和絕對豐度

為了進一步闡明不同組之間的細菌組成差異,三組的腸道微生物群的熱圖如圖7所示,人類腸道糞便中65種主要屬發現有顯著差異。將相對豐度低于1%的屬從類群中剔除后,選出17個屬進行比較,與對照組相比,fCS-Sc顯著增加了Megamonas(1.26倍)、Bacteroides(5.18倍)、Fusobacterium(13.3倍)、Parabacteroides(6.11倍)、Prevotella(21.0倍)、Faecalibacterium(17.0倍)的豐度,降低了Clostridium_XlVaBifidobacteriumDialisterEnterobacterPhascolarctobacteriumDorea的豐度。Megamonas可以產生醋酸鹽來促進脂肪生成和膽固醇形成,它在FOS組中也有顯著的增加,如先前報道一樣。類桿菌是產生SCFAs的細菌,在維持微生物區系中起著重要的作用,可能與抗菌能力有關。Prevotella與難消化碳水化合物的水解有關,而且Prevotella增多可能會調節血糖,降低患糖尿病的風險。BacteroidesPrevotella是兩種利用fCS-Sc的有益腸道菌群,而Clostridium_XlVa被認為是條件致病菌,Dorea被認為是促炎癥屬,這兩種菌在fCS-Sc組均明顯減少。這些研究結果表明,fCS-Sc通過增加有益菌的數量和抑制病原微生物對腸道菌群具有調節作用。


屬水平腸道微生物組成的熱圖


發酵過程中產生的SCFAs

SCFAs(短鏈脂肪酸)是腸道菌群對不溶性多糖的主要發酵產物,對維持大腸正常功能和結腸上皮細胞形態具有重要作用。不同組別發酵24小時后的SCFAs含量見表2,結果表明,樣品中的主要發酵產物為乙酸、丙酸和異丁酸。fCS-Sc能明顯促進乙酸、丁酸和異戊酸的產生,另一方面,FOS處理使乙酸、丙酸含量顯著增加,異丁酸含量顯著降低。FOS組未檢測到丁酸和異戊酸。

2 體外發酵過程中短鏈脂肪酸的產生

研究結論

HPSEC-MALLS-Visc-RI結果表明,fCS-Sc在PBS中呈剛性棒狀鏈構象。Mw、[η]、Rh和構象參數αη和αh分別為63.2±0.6 kDa、64.1±0.3mL/g、9.62±0.03nm、1.11±0.01和0.70±0.01。根據類蠕蟲柱體模型計算了更多的構象參數,結果表明,ML,q,d, C分別為793g/mol?nm、11.22±0.60nm、1.00nm和21.4,結果表明fCS-Sc具有一定的鏈剛度。剛果紅試驗表明,fCS-Sc具有高度有序的單螺旋結構。fCS-Sc在較寬的ph范圍內呈現負zeta電位,熱穩定性較好。此外,fCS-Sc通過促進腸道菌群的豐富性和多樣性,促進有益細菌生長和SCFAs(短鏈脂肪酸)的產生,對腸道菌群有顯著的調節作用。本研究有助于了解fCSs的鏈構象及其在食品、醫藥等行業中的應用。

常規擴增子測序和qPCR技術痛點

     常規16S擴增子測序技術雖然其具有高通量,低花費,可客觀還原菌群結構及相對豐度比例的巨大優勢,但是其是通過某一OTU分類單元的序列數所占總序列數的比值來獲得某個細菌的相對豐度比例信息,然而相對豐度信息不能反映樣本中物種真實的絕對豐度情況,例如微生物某一類群的相對豐度比例增加不一定真正是相應微生物類群的絕對豐度增加,可能是其它微生物類群的絕對豐度減少是導致其在群落結構中相對豐度比例的增長,因此常規16S擴增子測序技術基于相對定量分析的錯誤結果解釋可能導致假定的因果關系!

         qPCR絕對定量技術雖然可以進行物種絕對定量分析,但是qPCR定量實驗結果常常不穩定,且特定物種qPCR需要設計特定引物,對引物特異性要求較高,且引物優化難度較大,導致常規的qPCR絕對定量實驗不再適用于組成較為復雜的環境樣本微生物絕對定量。此外,當環境樣本中往往含有腐殖酸,這些腐殖酸會通過抑制酶的活性抑制PCR,從而影響qPCR對細菌拷貝數定量結果的準確性。

天昊16S擴增子絕對定量測序技術簡介

該技術是一種將qPCR絕對定量技術和常規16S擴增子測序技術合二為一的技術,該技術不但可以進行Alpha多樣性分析、群落組成分析、Beta多樣性分析、指標和微生物相關性分析等常規16S擴增子測序分析,關鍵可以解析樣本中總細菌的絕對拷貝數,還可以解析樣本中每個物種的絕對拷貝數,因而對微生態學內許多懸而未決的問題具有進一步闡明的潛力。此外,該技術進行細菌拷貝數定量時,構建標準曲線的內標和樣本DNA是在同一個樣本孔中一起進行PCR反應,所以PCR反應效率相同,因此校正了腐殖酸對PCR的影響,避免了腐殖酸等PCR抑制物對樣品細菌16S拷貝數定量的影響,因此針對土壤、水體和淤泥等環境樣本,天昊生物16S擴增子絕對定量測序技術計算得到的細菌16S拷貝數相對于qPCR更準確。

天昊16S擴增子絕對定量測序技術應用情況

目前天昊微生物16S擴增子絕對定量測序技術平臺已經完成項目近百個,合作單位包括中國科學院微生物研究所、中國科學院南京土壤研究所、中國科學院水生生物研究所、同濟大學環境科學與工程學院、廈門大學環境與生態學院、中國農業大學、南京農業大學、東北農業大學、重慶市農業科學院、鹽城工學院、南京財經大學、南京中醫藥大學、武漢大學中南醫院、新疆醫科大學公共衛生學院、山東大學齊魯醫院等多個單位,覆蓋環境土壤微生物,環境水體微生物和醫學腸道微生物等多個領域,利用該技術的項目文章成功發表在環境科學期刊《Science of the Total Environment》(IF= 5.589)和應用化學1區期刊《Carbohydrate Polymers》(IF=6.044)上,目前該技術因其創新性、準確性和穩定性受到客戶的廣泛好評! 天昊生物目前是國內唯一一家提供 “微生物16S擴增子絕對定量測序”技術的服務商,熱烈歡迎各位老師與我們交流溝通!

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